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Secuenciamiento de los genes de las proteínas
verde y roja ourescentes del pez cebra transgénico
(Danio rerio) introducido al Perú
rEsumEn
En el año 2006 se identicó el primer movimiento
transfronterizo de peces cebra uorescentes al territorio
peruano. Se tiene poco conocimiento del posible impacto
ambiental ante la liberación descontrolada de estos peces
transgénicos uorescentes. Así como, los orígenes y ujo génico
de estos organismos hidrobiológicos. Se analizó por PCR los
genes de uorescencia GFP (Proteína uorescente verde) y
RFP (Proteína uorescente roja) en peces cebra transgénicos
introducidos dentro del territorio peruano y de peces cebra
procedentes de Colombia, Chile y de Taiwán como controles
positivos. Todas las secuencias nucleotídicas correspondían a
la proteína uorescente roja (drFP583) de la anémona marina
Discosoma sp. con un tamaño de 505pb (RFP) y de su variante
verde (GFP) con un tamaño de 570pb. Asimismo, el análisis
logenético evidenció un origen asiático del movimiento
transfronterizo de estos peces por una ruta sudamericana vía
Colombia principalmente hacia territorio peruano.
Palabras clave: GFP, RFP, pez cebra, uorescencia, Discosoma,
transfronterizo
aBstraCt
In 2006, the rst transboundary movement of uorescent
zebrash to the Peruvian territory was identied. Little is
known about the possible environmental impact due to the
uncontrolled release of these transgenic uorescent sh. As
well as, the origins and gene ow of these hydrobiological
organisms. e uorescence genes GFP (Green Fluorescent
Protein) and RFP (Red Fluorescent Protein) in transgenic
Zebrash introduced into the Peruvian territory and Zebrash
from Colombia, Chile and Taiwan as positive controls were
analyzed by PCR. All nucleotide sequences corresponded to
the red uorescent protein (drFP583) of the marine anemone
Discosoma sp. with a size of 505pb (RFP) and its green variant
(GFP) with a size of 570pb. Likewise, the phylogenetic analysis
evidenced an Asian origin of the transboundary movement of
these sh along a South American route via Colombia, mainly
to Peruvian territory.
Key words: GFP, RFP, zebrash, uorescence, Dyscosoma,
transboundary
C S
,
R C
J M
L I
M Q
C A
1 Laboratorio de Mejora Genética y
Reproducción Animal, Facultad de
Ciencias Naturales y Matemática,
Universidad Nacional Federico Villarreal,
Lima. Perú.
Email: cscotto@unfv.edu.com
2 Módulo dulceacuícola. Facultad de Cien-
cias de la Universidad Ricardo Palma.
Lima. Perú.
Email: carlos.scotto@urp.edu.pe
3 Universidad César Vallejo. Filial Este.
Lima. Perú.
Email: carriolap15@gmail.com
Sequencing of the genes of the uorescent green and red proteins of
the transgenic zebrash (Danio rerio) introduced to peru
Recibido: noviembre 20 de 2019 | Revisado: diciembre 12 de 2019 | Aceptado: enero 17 de 2020
https://doi.org/10.24265/campus.2020.v25n29.01
| C | V. XX V | N. 29 | PP. - | - | |
© Los autores. Este artículo es publicado por la Revista Campus de la Facultad de Ingeniería y Arquitectura de la Universidad
de San Martín de Porres. Este artículo se distribuye en los términos de la Licencia Creative Commons Atribución No-comercial
– Compartir-Igual 4.0 Internacional (https://creativecommons.org/licenses/ CC-BY), que permite el uso no comercial,
distribución y reproducción en cualquier medio siempre que la obra original sea debidamente citada. Para uso comercial
contactar a: revistacampus@usmp.pe.
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Introducción
El 9 de diciembre del 2011, el
Gobierno Peruano promulgó la Ley
N° 29811 que establece la Moratoria al
Ingreso y Producción de Organismos
Vivos Modicados (OVM o transgénicos)
destinados a la liberación intencional al
ambiente por un periodo de 10 años.
La nalidad de la ley es fortalecer las
capacidades en bioseguridad, desarrollar
la infraestructura requerida y generar
las líneas de base que permitan una
adecuada evaluación de las actividades de
liberación de OVMs al ambiente. En ese
escenario, se percibe que la producción
y/o liberación de transgénicos atentaría
contra la biodiversidad por el potencial
riesgo de ujo genético no controlado y
que afectaría al Perú como “Centro de
origen o de Diversidad Biológica”.
Es importante decir que el Perú
forma parte del Protocolo de Cartagena
sobre Seguridad de la Biotecnología
del Convenio sobre la Diversidad
Biológica que regula los movimientos de
Organismos Genéticamente Modicados
(GMO) de un país a otro (CIISB/BCH-
Perú, 2015). Existe desde el año 2011
una Ley Moratoria en el Perú (Ley N°
29811) a la liberación de cualquier OVM
introducido y/o producido basado
en el Principio Precautorio ante la
incertidumbre de si se puede producir
daño ambiental o a la biodiversidad o
no. Actualmente, la Ley N° 27104 habla
sobre la prevención de riesgos derivados
del uso de la biotecnología moderna
referida a los OVM con la nalidad de
prevenir, evitar o reducir los posibles
efectos adversos para garantizar un
nivel adecuado de protección para la
salud humana, la diversidad biológica
y el medioambiente de los OVM y sus
productos derivados haciendo hincapié
en los puntos controversiales como son
su liberación al ambiente o el uso en
ambientes connados.
A principios del siglo XXI, se
desarrollaron a nivel de laboratorio los
primeros peces ornamentales transgénicos.
La técnica para la obtención de estos OVM
consistió en la introducción de genes
que producen proteínas uorescentes de
colores verde (GFP, Green Fluorescent
Protein), rojo (RFP, Red Fluorescent
Protein), entre otros, extraídos primero
de la medusa abisal Aequorea victoria
(Murbach y Shearer, 1902) y luego de la
anémona de mar [(Anemonia manjano
(Carlgren,1900)] y otros organismos
marinos (Gong et al., 2001; Wan et al.,
2002; Udvadia & Linney, 2003).
Los primeros peces transgénicos
uorescentes fueron diseñados como
mascotas de acuario. Como el pez Medaka
[Oryzias latipes (Temminck y Schlegel,
1846)] (Tanaka et al., 2001; Nguyen
et al., 2014) y el pez cebra [Danio rerio
(Hamilton,1822)] (Gong et al., 2003).
Principalmente se desarrollaron para
ser comercializados en los mercados
de los Estados Unidos (http://www.
glosh.com) y de Taiwán (http://
www.azoo.com.tw) respectivamente.
Actualmente, se comercializan varias
especies genéticamente modicadas
de peces ornamentales uorescentes
dulceacuícolas en el mundo tales como:
pez cebra [Danio rerio (Hamilton, 1822)];
el pez Monjita o Tetra [Gymnocorymbus
ternetzi (Boulenger, 1895)]; el Barbo
sumatrano [Puntius tetrazona (Bleeker,
1855)]; el pez Medaka japones [Oryzias
latipes (Temminck y Schlegel, 1846)]; el
pez ángel o Escalar [Pterophyllum scalare
(Lichtenstein, 1823)]; el Cíclido convicto
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[Amatitlania nigrofasciata (Günther,
1867)]; el Neón chino [Tanichthys
albonubes (Lin, 1932)] entre otros
(Bielikova, 2012; Pan et al., 2008; Qing
et al, 2012; Zhu & Zon, 2004).
En el año 2006, se identicó el primer
movimiento transfronterizo de peces cebra
uorescentes al territorio peruano (Scotto,
2011) (Figura 2). Posteriormente, se
logró su reproducción e hibridación en
cautiverio (Scotto, 2012). Y en el 2013, se
logró la primera identicación de peces
cebra con la proteína roja uorescente de la
anémona de mar [(Discosoma sp. (Forsskål,
1775)] en el Perú mediante el análisis de
transgenes (Scotto & Serna, 2013). En
el año 2015, se obtuvieron otros peces
uorescentes transgénicos que salieron al
mercado mundial en las especies: Puntius
tetrazona y Epalzeorhynchos frenatum
(Glosh, 2018).
En el año 2018 ya se reporta el segundo
ingreso al territorio peruano de peces
ornamentales Monjita o tetra transgénicos
(Gymnocorymbus ternetzi) (Scotto,2018).
En el año 2016, se comprobó el ujo
génico de los transgenes GFP y RFP de los
parentales a la progenie F1 en condiciones
connadas en el pez cebra (Scotto &
Chuan, 2018). Así mismo, se reportó la
captura de peces cebra uorescentes de
color rojo liberados en la cuenca del río
Amazonas en el departamento de Loreto
(MINAM, 2016). Hoy en día, se tiene
poco conocimiento del posible impacto
ambiental ante la liberación descontrolada
de estos peces transgénicos por la falta de
un análisis de riesgos que evalué su ujo
génico (Manzi, 2016).
En el Perú, existen zonas climáticas
térmicamente muy semejantes a las zonas
de origen de donde proceden la mayoría
de estos peces exóticos (del Sudeste
Asiático, de América Central y del Sur)
y que podrían reproducirse y prosperar
en estas zonas como son la costa norte
del Perú (departamentos de Tumbes,
Piura, La Libertad y Lambayeque). Y los
departamentos con zonas selváticas donde
la temperatura supera los 24°C como
son: Cajamarca, Amazonas, San Martín,
Junín, Huánuco, Pasco, Cuzco, Loreto,
Ucayali y Madre de Dios (Scotto, 2016).
El objetivo de este trabajo fue evidenciar
molecularmente el ujo génico de los peces
cebras transgénicos uorescentes rojo y
verde procedente del extranjero.
Método
Materiales y métodos de identicación
de la uorescencia en peces cebra
Se realizó conrmación de la
presencia (Transgénico) o ausencia (No
transgénico) de uorescencia corporal
mediante la exposición de cada pez ante
la luz ultravioleta de un transiluminador
de menos de 400 nm de longitud de onda
por treinta segundos (Figura 1).
Extracción de ADN de tejido muscular
de pez cebra
Se extrajo 200mg del músculo dorsal
del pez y colocó en un tubo ependor de
1.5 ml estéril para ser procesado con el
Kit de extracción de ADN gSYNCTM.
Se agregó 0,5 volúmenes de agua libre de
nucleasas y homogenizó con un mortero
estéril. Se extrajo 50 ml del sobrenandante
y homogenizó según el protocolo del Kit
DNeasy Blood & Tissue. Finalmente se
deluyó en 100ul de buer de elución y
sembró 3ul de buer de carga 3X más 6ul
de ADN extraído en cada pocillo del gel
de agarosa. Las muestras fueron corridas
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en un gel de agarosa al 1.5% para observar
la calidad del ADN extraído comparado
con la banda de 23 100 pb del marcador
de peso molecular Fago lambda digerido
con Hind III (Figura 2).
Amplicación por PCR de la GFP
y RFP en peces cebra uorescentes
transgénicos
La amplicación por PCR se trabajó
con una concentración de 40ng/ul de
cada muestra (Volumen nal de 25ul):
14.3ul de agua libre de nucleasas, 5ul
de buer 5X Green Colorless Go Taq
Flexi, 0.5ul de dNTPs (25nm), 0.5ul de
primer GFP/RFP Forward o Reverse (10
uM), 0.2ul de polimerasa Go taq DNA
(5u/ul) y 0.2ul de muestra de ADN. Las
condiciones de ciclaje para el PCR fueron
las siguientes: Activación inicial de dos
minutos a 95°C, 35 ciclos de 30 segundos
a 95°C, 30 segundos a 62°C y minuto a
72°C seguido por una extensión nal
de cinco minutos a 72°C. El producto
amplicado fue analizado mediante una
electroforesis en geles de agarosa al 1.5%.
Se utilizó un marcador de peso molecular
de 100pb comercial. Los primers
utilizados para identicar a los transgenes
de GFP y RFP fueron los reportados
por Bielikova et al. (2012) y Rehbein y
Bogerd (2007) (Tabla 1). Se usó como
controles negativos a peces cebra de color
gris y blanco no uorescentes.
Los amplicados de GFP (570 pb)
y RFP (505 pb) puricados fueron
enviados a secuenciar al extranjero.
Tabla 1
Secuencias de primers utilizados para identicar peces cebra transgénicos
Gen
Nombre Secuencia (5’ - 3’)
Tamaño
en pb
Referencia
GFP GFP1F 5’-TCGAGCTGGACGGCGACGT-3’
570
Bielikova et al.
(2012)
GFP GFP1R 5’-GGTGCTCAGGTAGTGGTTGTC-3’
RFP
RFP/
Rerio2006
5’-ACAACACCGTGAAGCTGAAGGTGACCAAG-3’
505
Rehbein & Bogerd
(2007)
RFP
RFP/
Rerio2006
5’-GGTGTAGTCCTCGTTGTGGGAGGTGATGTC-3’
Análisis molecular de las secuencias de
GFP y RFP
Con la información molecular se
editó y alineó las secuencias con el
programa Bioedit (Versión 7.0.4, 2005)
y se construyó el árbol logenético con el
programa MEGA X (Kumar et al., 2018).
Se comparó la secuencia nucleotídica del
GFP de 573 nucleótidos de dos peces
cebras uorescentes verdes (Uno de Perú
y otro de Colombia) con la secuencia
del pez Medaka uorescente verde
importado de Taiwán como control
positivo. Asimismo, se comparó las
secuencias nucleotídicas del RFP de 482
nucleótidos de dos peces cebras (Uno de
Perú y otro de Colombia) con el RFP
secuenciado del pez cebra importado de
Taiwán como control positivo.
Resultados y discusión
En la Figura 1, se observa peces
cebra uorescentes de color verde y rojo
en contraste con el pez cebra de color
blanco no transgénico. Se evidencia la
uorescencia ante luz UV.
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Figura 2. Gel de la Calidad del ADN extraído de pez cebra (Danio rerio)
uorescentes. Carriles 1, 2 y 3 = Peces cebra verde (GFP). Carriles 4, 5 y 6
= Peces cebras rojos (RFP). M = Marcador de peso molecular Fago lambda
digerido con Hind III.
Figura 1. Peces Cebras (Danio rerio) con luz natural. A = Línea blanca no transgénica. B = Línea
verde uorescente. C = Línea roja uorescente. Peces Cebras (Danio rerio) ante luz UV. A =
Línea blanca no transgénica. B = Línea verde uorescente. C = Línea roja uorescente.
En la Figura 2, se observa la calidad
del ADN extraído de los peces cebra
uorescentes de color verde y rojo pues
solo se evidencia una sola banda.
En la Figura 3, se observa las bandas
del ADN amplicadas para identicar
los transgenes de la proteína verde
uorescente (GFP) y la proteína roja
uorescente (RFP) de los peces cebra
uorescentes de color verde y rojo
respectivamente. Los peces cebra de color
gris y blanco no evidenciaron ninguna
banda amplicada.
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Figura 3. Gel de amplicado de pez cebra (Danio rerio). Carril 1 y 10 = Marcador de peso molecular
de 100pb. Carriles 2 y 3 = Pez cebra transgénico de color rojo importado de Chile (RFP). Carriles
4 y 5 = Pez cebra transgénico de color rojo de Perú (RFP). Carril 6 y 7 = Pez cebra transgénico de
color verde (GFP) importado de Colombia. 8 y 9 = Pez cebra transgénico uorescentes de color
verde (GFP) de Perú. Carril 11 = Pez cebra transgénico de color rojo de Taiwán (Control positivo
de RFP). Carril 12 = Pez Medaka transgénico de color verde de Taiwán (Control positivo de GFP).
Carriles 13 y 14 = Pez cebra gris no uorescente (Control negativo). Carril 15 = Pez cebra blanco
no uorescente (Control negativo). Carril 16 = Control de reactivos de amplicación por PCR.
Figura 4. Análisis múltiple de las secuencias nucleotídicas alineadas (Programa Bioedit, 2005).
A. Secuencias de la proteína Fluorescente Verde (GFP). B. Secuencias de la proteína uorescente
roja (RFP). Tg = Transgénico.
El alineamiento de las secuencias
nucleotídicas de GFP y de RFP
mostraron mucha similitud entre sí. Así
para la proteína GFP la similaridad fue
mayor entre los peces cebra de Perú y
Colombia cuyo valor fue de 97.4% que
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con respecto al pez Medaka de Taiwán
que fue de 96%.
Para la proteína RFP la similaridad
fue mayor entre los peces cebra de Perú
y de Taiwán de 93.9% que con respecto
al pez cebra de Chile que fue de 91.2%.
En la Figura 5, se observa el árbol
logenético obtenido de las secuencias
de la GFP en el pez cebra uorescente
verde (Control pez Medaka uorescente
verde de Taiwán).
Figura 5. Árbol logenético obtenido de las secuencias de la GFP de los peces cebra uorescentes
verdes del Perú y de Colombia (Control positivo = Pez Medaka uorescente verde con GFP de
Taiwán).
En la Figura 6, se observa el árbol
logenético obtenido de las secuencias de
la RFP en el pez cebra uorescente rojo
(Control pez cebra uorescente rojo de
Taiwán).
Si bien la tecnología basada en la
inserción de proteínas uorescentes de
“Colores vivos” para generar nuevas
Figura 6. Árbol logenético obtenido de las secuencias de la GFP de los peces cebra uorescentes
rojos del Perú y de Chile (Control positivo = Pez cebra uorescente rojo de con RFP de Taiwán).
variedades o líneas de diversos peces
ornamentales transgénicos estables y
cuyo auge es creciente en el acuarismo
S
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mundial actualmente. Las publicaciones
cientícas de ellos son muy escasas o
no están disponibles sus secuencias y
transgenia por lo que la estandarización
de la tecnología sobre el tipo de
constructor utilizado y el mecanismo
de introducción de los transgenes
uorescentes no es de dominio público.
Lo cual diculta el empleo de métodos
de detección molecular estandarizados
de los mismos y poder así generar una
vigilancia y scalización efectiva sobre
la liberación accidental o deliberada
de estos organismos hidrobiológicos
modicados por ingeniería genética. En
el presente trabajo se logró evidenciar la
uorescencia verde (GFP) y roja (RFP)
de los peces cebras uorescentes de los
no transgénicos de las líneas gris y blanca
ya reportado previamente por diversos
autores (Ofelio et al., 2012; Tonelli et al.,
2017) (Figura 1).
El proceso de extracción de ADN fue
bueno evidenciándose solo una banda
detallada para el proceso de amplicación
por PCR. Todas las muestras de peces
cebras (Danio rerio) de color rojo
uorescentes dieron positivo para el
transgen de la proteína uorescente roja
(RFP) con una secuencia de una longitud
de 505pb. Asimismo, todas las muestras
de peces cebras (Danio rerio) de color
verde uorescentes dieron positivo para
el transgen de la proteína uorescente
verde (GFP) con una secuencia de una
longitud de 570pb (Figura 2).
Se logró identicar los mismos
transgenes de GFP y RFP en peces cebras
reportados por Bielikova et al. (2012) y
Rehbein y Bogerd (2007) (Figura 3).
Sin embargo, todas las muestras de
peces cebras (Danio rerio) de color rojo
uorescentes de Chile y Perú dieron
positivo para el transgen de la proteína
uorescente verde (GFP). Lo cual
indicaría procesos de cruzamiento entre
estas dos líneas transgénicas.
De los resultados de los análisis
logenéticos de la Figuras 4 y 5, se
puede concluir que el movimiento
transfronterizo de estas especies
ornamentales tendría una procedencia
desde el continente asiático (Taiwán,
China, Singapur). Esta ruta asiática
vendría a países donde no está prohibida su
importación como Colombia y Ecuador.
Y desde ahí pasan a territorio peruano,
llegan al norte del Perú (Lambayeque y
La Libertad) y departamentos de la selva
(San Martín, Loreto). Aquí los acuaristas
peruanos los reproducen en grandes
lotes de animales puros o cruzados para
ser distribuidos a la capital Lima y otros
departamentos alejados como Arequipa,
Cuzco, Puno y Tacna donde han sido
reportados. Y desde ahí serían exportados
a países vecinos sudamericanos como
Chile, Bolivia y probablemente a
Argentina donde ya han sido reportados
(Sernapesca de Chile, comunicación
personal).
La tendencia mundial es incrementar
el número de especies ornamentales
transgénicas y con nuevos colores
uorescentes. Estas especies serán cada vez
más vistosas y grandes en tamaño corporal
donde el color “bioluminiscente” resalte
más en un acuario. Económicamente el
mayor precio por un pez uorescente le
otorgará mayores ganancias al criador o
acuarista lo que crea un mercado muy
rentable. A pesar de existir leyes y/o
normativas que buscan regularlo, pero
sin mucho éxito.
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Conclusiones
Las muestras de peces cebras (Danio
rerio) de color rojo uorescentes dieron
positivo para el transgen de la proteína
uorescente roja (RFP) con una secuencia
de una longitud de 505pb. Asimismo,
todas las muestras de peces cebras
(Danio rerio) de color verde uorescentes
arrojaron positivo para el transgen de la
proteína uorescente verde (GFP) con
una secuencia de una longitud de 570pb.
Las muestras de peces cebras (Danio rerio)
de color rojo uorescentes dieron positivo
para el transgen de la proteína uorescente
verde (GFP). Probablemente, existe
cruzamiento indiscriminado entre ambos
tipos de peces cebra transgénicos (rojos y
verdes). A pesar de que la uorescencia
se muestra solo el color rojo en el cuerpo
del animal. Las secuencias de RFP y
GFP poseen mucha similitud en su
secuencia nucleotídica y corresponderían
a la proteína uorescente Roja (drFP583)
de la anémona marina Discosoma
sp. (Genbank No. Q9U6Y8.1). Del
análisis logenético los resultados para
el gen de la GFP evidenciaron mucha
homología molecular entre los peces
cebras uorescentes verdes de Perú
y de Colombia. Se puede deducir el
movimiento transfronterizo de estos
peces a territorio peruano. Para el gen de
la RFP evidenciaron mucha homología
molecular entre los peces cebras
uorescentes rojos de Perú y de Taiwán.
Se supone un movimiento transfronterizo
desde países asiáticos productores de
peces ornamentales uorescentes rumbo
a Perú, pero pasando primero por la ruta
Sudamérica (Ecuador y Colombia) al
territorio peruano debido a la ley de la
moratoria que prohíbe su importación.
Caso que no pasaría con Chile, donde
el ingreso podría ser directamente de
importaciones de países asiáticos a dentro
de su territorio sin necesariamente cruzar
territorio peruano.
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