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Callos embriogénicos y proembriones inducidos
en cotiledones de Pouteria lucuma, var. “seda”,
utilizando reguladores del crecimiento
resumen
El lúcumo es un cultivo de interés por su consumo humano y su
aplicación industrial, pero hay problemas en su productividad
debido a su variabilidad genética. Los cultivos in vitro, en especial
la embriogénesis somática, puede ayudar a su mejoramiento,
pero primero debemos conocer la competencia del explante.
Por tanto, el objetivo es inducir callos embriogénicos y
proembriones a partir de cotiledones, maduros e inmaduros,
de Pouteria lúcuma “lúcuma”. Para ello se utilizó el medio de
cultivo de Murashige & Skoog suplementado con diferentes
combinaciones de benciladenina purina, ácido naftalén acético
y 2,4-diclorofenoxiacético. Los resultados muestran que los
cotiledones inmaduros forman pro-embriones a los 63 días en
T6 y 95 días en T7 (5 ppm BAP y 3 ppm de 2,4-D) y en los
cotiledones maduros solo se observaron callos embriogénicos a
los 58 días en T7. Se concluye que los cotiledones inmaduros es
el explante que muestra mejores respuestas en la formación de
callos embriogénicos y pro-embriones.
Palabras clave: callo embriogénico, embriogénesis somática,
lúcuma, auxinas, citoquininas
absTracT
Lucumo is a crop of interest for its human consumption
and its industrial application, but there are problems in its
productivity due to its genetic variability. In vitro cultures,
especially somatic embryogenesis can help its improvement,
but rst, we must know the competence of the explant. With
the above, the objective was to induce embryogenic calluses
and proembryos from cotyledons, mature and immature, of
Pouteria lucuma “lucuma”. For this, the Murashige & Skoog
culture medium supplemented with dierent combinations
of benzyl adenine purine, naphthalene acetic acid, and
2,4-dichlorophenoxyacetic acid was used. e results show that
immature cotyledons form pro-embryos at 63 days in T6 and
95 days in T7 (5 ppm BAP and 3 ppm of 2,4-D) and in mature
cotyledons only embryogenic calli were observed at 58 days at
T7. It is concluded that immature cotyledons are the explant
that shows better responses in the formation of embryogenic
and pro-embryonic calluses.
Keywords: embryogenic callus, somatic embryogenesis,
lucuma, auxins, cytokinins
Embryogenic callus and proembryos induced in cotyledons of Pouteria
lucuma, var. “seda”, using growth regulators
Recibido: noviembre 17 de 2022 | Revisado: noviembre 20 de 2022 | Aceptado: noviembre 28 de 2022
J C-R
C M-L
L C-R
C D-F
L G-L
1
Laboratorio de experimentación Vegetal.
Universidad Nacional de Trujillo. Trujillo-
Perú
2
Laboratorio de Biotecnología. Universidad
Nacional de Santa. Chimbote-Perú
3
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Trujillo-Perú
4
Laboratorio de Experimentación Vegetal.
Universidad Nacional de Trujillo. Trujillo-
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5
Laboratorio de Ciencias. Universidad
Toribio Rodríguez de Mendoza.
Chachapoyas-Perú
Autor para correspondencia E-mail:
2jchico@unitru.edu.pe
© Los autores. Este artículo es publicado por la Revista Campus de la Facultad de Ingeniería y Arquitectura de la Universidad
de San Martín de Porres. Este artículo se distribuye en los términos de la Licencia Creative Commons Atribución No-comercial
– Compartir-Igual 4.0 Internacional (https://creativecommons.org/licenses/ CC-BY), que permite el uso no comercial,
distribución y reproducción en cualquier medio siempre que la obra original sea debidamente citada. Para uso comercial
contactar a: revistacampus@usmp.pe.
https://doi.org/10.24265/campus.2022.v27n34.12
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Introducción
Pouteria lucuma (R. & P.),” lúcuma”,
Sapotaceae, se cultiva en los valles
interandinos de Perú, Ecuador y al nivel
del mar en Chile (Padilla et al. 2006; Balbi,
2004; Yahia & Gutiérrez-Orozco, 2011).
Puede ser utilizada como fruta, harina,
tintes, textiles, medicina, etc. (Malca,
2000; Maza-De la Quintana & Paúcar-
Menacho, 2020) y como en la mayoría de
los árboles, su propagación convencional
es por semilla sexual e injertos, pero
estos métodos tienen limitaciones como:
naturaleza perenne, ciclo de vida muy
largo especialmente la fase juvenil, auto
incompatibilidad, baja tasa de éxito en la
polinización, tiempo de maduración de
la semilla muy larga, diferencia clonal en
el tiempo de oración, elevado nivel de
heterocigocidad y otros, (Franciosi, 1995;
Mondal et al.,2005; Córdova-Risco et al.,
2017; Quijano & Prieto, 2020).
Con estas referencias se hace necesario
realizar actividades de mejoramiento con
las técnicas de cultivo in vitro de tejidos
vegetales, la cual nos va a permitir una
propagación rápida, masiva y uniformidad
genética.
La regeneración de plantas directamente
de los explantes, o a partir de callos,
por medio de la organogénesis o de la
embriogénesis somática se ha utilizado
como una alternativa en los métodos de
propagación in vitro (Tripathi et al., 2021;
Roca & Mroginski, 1990).
La embriogénesis somática es una
técnica eciente por el número de plantas
regeneradas por unidad de tiempo y
además cualquier parte de la planta puede
ser inducida a formar embriones somáticos
utilizando auxinas y citocininas, los
cuales son los principales reguladores del
crecimiento implicadas en la regulación
de la división, la diferenciación y
especialmente en la inducción de
embriones somáticos (Wang et al., 2008;
Yu et al., 2008; Martinez et al., 2010).
Investigaciones relacionadas al tema
demuestran que utilizar bencilaminopurina
(BAP), para la inducción de embriogénesis
tiene mejores resultados que las otras
citocininas en Quercus rubra; Persea
americana, Coea arabica, eobroma
cacao, Eucalyptus globulus, Carica papaya,
Pinus pinea (Vengadesan & Pijut, 2009;
Vidales-Fernández et al., 2003; Quiroz-
Figueroa et al., 2002; Silva et al., 2005:
Nugent et al., 2001; Carneros et al., 2009).
En P. lucuma se demostró que utilizando
plantas jóvenes como explantos se obtienen
buenos resultados para la formación de
callos y desarrollo de protocolos para su
micropropagación, usando especialmente
kinetina, bencilaminopurina (BAP) y
ácido naftalenacético (ANA) (Padilla et
al., 2006; Jordan et al., 1994, Jordan &
Oyanedel, 1992).
Frente a la necesidad de buscar
nuevas fuentes vegetales que puedan ser
mejoradas y utilizadas en el consumo
humano o como productos industriales es
que se justica realizar investigaciones que
vayan mejorando este cultivo. Por ello nos
planteamos inducir callos embriogénicos
y proembriones a partir de cotiledones
de P. lúcuma var. “seda”, utilizando para
ello combinaciones de reguladores de
crecimiento.
Método
Material vegetal: se utilizaron
cotiledones de frutos maduros e
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inmaduros de lúcuma de la variedad
“seda”, provenientes del distrito de
Moche (Trujillo).
Medio de cultivo y tratamientos: el
medio basal fue el de Murashige & Skoog
(MS, 1962) a la mitad de su concentración
normal, el cual fue suplementado con
reguladores del crecimiento (ANA, BAP
y 2,4- D), sacarosa (3%), agar (1%) y
pH de 6,5. El MS tuvo combinaciones
de reguladores de crecimiento según los
tratamientos explicados en la Tabla 1.
Tabla 1
Combinaciones de los reguladores de crecimiento para cada tratamiento
T1: 5 ppm de BAP + 0.5 ppm ANA T5: 5 ppm de BAP + 0.5 ppm 2,4-D
T2: 5 ppm de BAP + 1 ppm ANA T6: 5 ppm de BAP + 1 ppm 2,4-D
T3: 5 p pm de BAP + 3 ppm ANA T7: 5 ppm de BAP + 3 ppm 2,4-D
T4: 5 ppm de BAP + 5 ppm ANA T8: 5 ppm de BAP + 5 ppm 2,4-D
Introducción del explante, se
hicieron cortes longitudinales de los
cotiledones (1 x 1 cm), luego se procedió
a su desinfestación con alcohol al 70%
e hipoclorito de sodio al 2,5%. Una vez
introducido los explantes, estos fueron
llevados a una cámara oscura por 20 días,
pasado este tiempo se llevaron a la sala de
incubación donde recibieron fotoperiodo
de 16:8. La temperatura promedio fue de
25° C.
Se evaluó presencia de callos y de
proembriones. También se analizaron
los tipos de callos, su edad y color que
manifestaban. De los proembriones
se tuvo en cuenta la edad a partir del
momento en que aparecieron. Para el
análisis histológico, los callos de 45 y 60
días de edad, fueron jados en solución
AFA ( 1:1:18, formaldehido, ácido acético
glacial, alcohol al 70%) durante 48 horas,
luego fueron deshidratados con una
serie de grados alcohólicos, claricados
con xileno, embebidos en parana
y nalmente cortadas en secciones
de 8-10 µm utilizando u micrótomo
rotatorio (LEIC rm2245). Las secciones
se colorearon con hematoxilina/eosina
(Da Silva et al., 2015). La captura de
imágenes fue establecida utilizando un
microscopio de luz. Los datos fueron
sometidos a promedios, análisis de
varianza y prueba de Duncan con una
probabilidad de error del 5%.
Resultados
De los cotiledones inmaduros
se formaron proembriones y de los
cotiledones maduros solo se obtuvieron
callos con características embriogénicas.
Todos los tratamientos tienen BAP (Tabla
1) y en los cuatro primeros, T1, T2, T3 y
T4 (Tabla 1 y 2, Fig. 1a) la concentración
de ANA varía de 0.5 a 5 respectivamente
y entre ellos T2 y T3 presentaron el
mayor número de proembriones, 128.0
y 82.0 respectivamente, en cambio en T4
solo hay 3.0.
El otro grupo de tratamientos,
T5, T6, T7 y T8 tuvieron 2,4-D en
concentraciones de 0.5 a 5 ppm y se observó
que el número de proembriones fue
aumentando conforme la concentración
de 2,4-D también se eleva, pero cuando
ambas están a 5 ppm (BAP-2,4-D) solo
llegó a 9.0 (T8). Así T4 y T8 no permiten
el desarrollo de más proembriones. La
mayoría de estos emergió entre los 63 y
C P , . “”,
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95 días que corresponden a T6 y T7 y el
mejor tratamiento fue T7 con 647.
En la Tabla 3 se muestran los callos
obtenidos de los cotiledones maduros. En
los tratamientos con BAP-ANA ninguno
presentó callos con características
embriogénicas (CNE) y T2 no produjo
callos; en cambio los tratamientos con
BAP-2,4-D todos ellos indujeron callos
embriogénicos (CE) siendo T7 el que
produjo el mayor número de callos
(6.00). El color de los callos CNE fue
rojo, marrón y verde, especialmente, en
T3; en cambio los callos CE la mayoría
de ellos fue de color marrón claro.
En los cortes histológicos se observaron
células pequeñas en división, agrupadas,
diferenciándose de las células de su alrededor
que son más grandes (Fig. 1b). Esto es un
indicador que se inició la desdiferención en
los cotiledones. Por ello, observamos callos
embriogénicos y pro-embriones.
Tabla 2
Proembriones encontrados en cada tratamiento, procedentes de cotiledones inmaduros de P.
lúcuma var. “seda”. Los datos son promedio de tres repeticiones*
Tratamiento Edad (días) Pro-embriones* Duncan
T1 122 20.0c X
T2 123 128d X
T3 119 82.00 e X
T4 125 3.00 a X
T5 119 301.0 f X
T6 63 343.0 f X
T7 95 647.0g X
T8 112 9.0b X
Nota. Las letras diferentes indican diferencias signicativas entre los tratamientos con
p<0.05
Tabla 3
Descripción de los callos, para cada tratamiento, obtenidos de cotiledones maduros de P.
lucuma var. “seda”. La evaluación se hizo a partir de los 40 días de edad.
Tratamiento
Edad
(días)
CNE
1
CE
2
Callos
3
D
4
R M V
T1 68 2.00 0.00 - + - X
T2 40 0,00 0.00 - - - X
T3 58 3,00 0.00 + + + X
T4 58 1.33 0.00 - + - X
T5 40 0,00 2.00 a - + - X
T6 68 0,00 4.00 b - + - X
T7 58 0,00 6.00 c - + + X
T8 100 0.00 4.00b - + - X
Nota. Las letras diferentes indican diferencias signicativas entre los tratamientos con
p<0.05
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1
promedio de callos no embriogénicos
(CNE)
2
promedio de callos embriogénicos
(CE)
3
color de callos. R: rojo; M: marrón; V:
verde
4
test de Duncan
+ Presente
- Ausente
El análisis ANOVA (Tabla 2 y
3) muestra diferencias signicativas
entre los tratamientos; en la prueba de
Duncan (Tabla 2) se observa tres grupos
homogéneos para los tratamientos
con cotiledones inmaduros; para los
cotiledones maduros (Tabla 3) se
presentan dos grupos homogéneos.
Figura 1
A. Pro-embriones (echas) en estado de dos células, procedentes de cotiledones inmaduros in
vitro de P. lucuma var. “seda” (60 días de edad). Vista supercial. Coloración: rojo neutro.
Aumento 400x.
B. Centros embriogénicos (echa) con células pequeñas en división, Corte transversal de un
callo. Coloración: eosina. Aumento 400x.
Discusión
La presencia de proembriones y callos
embriogénicos (Tabla 2 y 3) es debido al
tratamiento hormonal, mediante la cual
las células inician una ruta de desarrollo
especíco. Conocer las concentraciones
de los principales grupos hormonales, así
como la relación entre ellos, en aquellas
especies en las cuales se puede inducir
fácilmente la embriogénesis somática,
podría permitir suplir la deciencia
o reducir el exceso de uno o más
compuestos, para lograr la inducción en
especies recalcitrantes para este proceso
son los comentarios de Serrano & Piñol,
1991 y Cordero, 2006.
La producción de callos necesita de una
auxina como se observa en la Tabla 3. Su
desarrollo implica expresión de diferentes
genes los cuales coneren a las células
somáticas su habilidad para manifestar
un potencial embriogénico (orpe,
C P , . “”,
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1995) con la síntesis de proteínas
especícas como las glicoproteínas que
pueden afectar el destino de las células
embriogénicas en la masa del callo
(Chugh & Khurana, 2002) o que dos
patrones de genes similares se expresan
simultáneamente, pero ocurren en
diferentes tiempos (Ghorbani-Marghashi
et al., 2012). La adquisición de la
competencia embriogénica depende,
principalmente, de su estado siológico y
condiciones ambientales y a nivel celular
por sus condiciones genéticas y de su
desarrollo (Feher, 2008; Naz et al., 2017;
Fareed et al., 2019).
La formación de un callo, compuesto
mayormente, por células uniformes, no
es considerado como una regresión en el
desarrollo del linaje, pero sí es un inicio
para incrementar su desarrollo potencial
(Feher, 2019). La reprogramación de un
callo puede inducir la regeneración de
una planta a través de organogénesis o
embriogénesis somática (Niazian et al.,
2019). El nuevo tejido que se origina en
el callo, en forma de células pequeñas y
se tiñen intensamente con el colorante,
son los nuevos centros embriogénicos que
proliferan de forma lenta e indiferenciada
(Lee & Pijut, 2017).
Luego se producen una serie de
rápidas y sucesivas divisiones celulares en
distintas zonas del centro embriogénico
y se forman los proembriones (Fig. 1b)
en los cuales su identidad celular, el
destino y la función está determinada
por el transcriptoma, por ejemplo, el set
completo de transcriptos expresados de
ARN (Chen etal., 2019; Czernicka et al.,
2021).
De esta manera, podemos decir
que el explante utilizado presenta
competencia y determinación para
iniciar la propagación masiva del
lúcumo, aplicando principalmente la
embriogénesis somática. Sugerimos
establecer un protocolo de propagación
que nos permita optar con la hormona
adecuada y optimizar el número de días
de inducción.
Conclusiones
El tratamiento con el mayor número
de proembriones, para los explantes de
cotiledones inmaduros de P. lucuma
var “seda” fue T7 (5 ppm BAP + 3
ppm 2,4-D) y este mismo fue capaz
de inducir 6.0 callos embriogénicos en
cotiledones maduros. Se comprueba que
el material vegetal debe ser joven para
inducir regeneración in vitro y se deben
desarrollar nuevos ensayos para obtener
los embriones somáticos a n de mejorar
la calidad del fruto.
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